RNA-Bearbeitung in praktischer Größe | MIT-Nachrichten

By | May 31, 2022
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Letztes Jahr entdeckten und charakterisierten Forscher des MIT McGovern Institute for Brain Research Cas7-11, das erste CRISPR-Enzym, das in der Lage ist, präzise, ​​gesteuerte Schnitte an RNA-Strängen vorzunehmen, ohne dabei Zellen zu schädigen. Jetzt hat dasselbe Team in Zusammenarbeit mit Mitarbeitern der Universität Tokio herausgefunden, dass Cas7-11 auf eine kompaktere Version geschrumpft werden kann, was es zu einer noch praktikableren Option für die Bearbeitung der RNA in lebenden Zellen macht. Das neue, kompakte Cas7-11 wurde am 27. Mai im Journal beschrieben Zelle zusammen mit einer detaillierten Strukturanalyse des ursprünglichen Enzyms.

„Als wir uns die Struktur ansahen, war klar, dass es einige Teile gab, die nicht benötigt wurden, die wir tatsächlich entfernen konnten“, sagt der Forschungswissenschaftler und McGovern-Stipendiat Omar Abudayyeh, der die neue Arbeit mit dem Forschungswissenschaftler und McGovern-Stipendiaten Jonathan Gootenberg leitete und Mitarbeiter Hiroshi Nishimasu von der Universität Tokio. „Das macht das Enzym klein genug, dass es für therapeutische Anwendungen in einen einzigen viralen Vektor passt.“

Die Autoren, zu denen auch der ehemalige Postdoc des McGovern-Instituts, Nathan Zhou, und Kazuki Kato von der Universität Tokio gehören, sehen in der neuen dreidimensionalen Struktur von Cas7-11 eine reichhaltige Ressource, um Fragen zur grundlegenden Biologie der Enzyme zu beantworten und andere Wege aufzuzeigen Optimieren Sie seine Funktion in der Zukunft.

RNA-Targeting

In den letzten zehn Jahren hat die CRISPR-Cas9-Genomeditierungstechnologie Forschern die Möglichkeit gegeben, die Gene in menschlichen Zellen zu modifizieren – ein Segen sowohl für die Grundlagenforschung als auch für die Entwicklung von Therapeutika zur Umkehrung krankheitsverursachender genetischer Mutationen. Aber CRISPR-Cas9 funktioniert nur, um DNA zu verändern, und für einige Forschungs- und klinische Zwecke ist die Bearbeitung von RNA effektiver oder nützlicher.

Eine Zelle behält ihre DNA lebenslang und gibt eine identische Kopie an die Tochterzellen weiter, wenn sie sich dupliziert, sodass alle Änderungen an der DNA relativ dauerhaft sind. RNA ist jedoch ein eher flüchtiges Molekül, das von DNA transkribiert und nicht lange danach abgebaut wird.

„Es hat viele positive Aspekte, die DNA dauerhaft verändern zu können, insbesondere wenn es um die Behandlung einer erblichen genetischen Krankheit geht“, sagt Gootenberg. „Aber bei einer Infektion, einer Verletzung oder einer anderen vorübergehenden Krankheit ist es sinnvoller, ein Gen durch RNA-Targeting vorübergehend zu modifizieren.“

Bis Abudayyeh, Gootenberg und ihre Kollegen Cas7-11 entdeckten und charakterisierten, hatte das einzige Enzym, das auf RNA abzielen konnte, eine unangenehme Nebenwirkung; Als es ein bestimmtes Gen erkannte, begann das Enzym – Cas13 – damit, die gesamte RNA um es herum zu zerschneiden. Diese Eigenschaft macht Cas13 effektiv für diagnostische Tests, wo es verwendet wird, um das Vorhandensein eines RNA-Stücks nachzuweisen, aber nicht sehr nützlich für Therapeutika, wo gezielte Schnitte erforderlich sind.

Die Entdeckung von Cas7-11 öffnete die Türen zu einer präziseren Form der RNA-Bearbeitung, analog zum Cas9-Enzym für DNA. Das massive Cas7-11-Protein war jedoch zu groß, um in einen einzelnen viralen Vektor zu passen – die leere Hülle eines Virus, die Forscher normalerweise verwenden, um Gen-Editing-Maschinen in die Zellen des Patienten zu bringen.

Struktureller Einblick

Um die Gesamtstruktur von Cas7-11 zu bestimmen, verwendeten Abudayyeh, Gootenberg und Nishimasu Kryo-Elektronenmikroskopie, die Elektronenstrahlen auf gefrorene Proteinproben richtet und misst, wie die Strahlen übertragen werden. Die Forscher wussten, dass Cas7-11 wie eine Verschmelzung von fünf separaten Cas-Enzymen war, die zu einem einzigen Gen verschmolzen waren, waren sich aber nicht sicher, wie diese Teile genau gefaltet und zusammengefügt wurden.

„Das wirklich Faszinierende an Cas7-11 aus fundamentalbiologischer Sicht ist, dass all diese separaten Teile zusammenkommen sollten, aber stattdessen eine Verschmelzung zu einem Gen vorliegt“, sagt Gootenberg. „Wir wussten wirklich nicht, wie das aussehen würde.“

Die Struktur von Cas7-11, das bei der Bindung sowohl seines Ziel-tRNA-Strangs als auch der Leit-RNA, die diese Bindung steuert, gefangen war, zeigte, wie die Teile zusammengesetzt wurden und welche Teile des Proteins für das Erkennen und Schneiden von RNA entscheidend waren. Diese Art struktureller Einblicke ist entscheidend, um herauszufinden, wie Cas7-11 dazu gebracht werden kann, gezielte Aufgaben in menschlichen Zellen auszuführen.

Die Struktur beleuchtet auch einen Abschnitt des Proteins, der offensichtlich keine funktionelle Rolle spielte. Dieser Befund deutet darauf hin, dass die Forscher es entfernen könnten, indem sie Cas7-11 umgestalteten, um es kleiner zu machen, ohne ihm die Fähigkeit zu nehmen, auf RNA zu zielen. Abudayyeh und Gootenberg testeten die Auswirkungen des Entfernens verschiedener Teile dieses Abschnitts, was zu einer neuen kompakten Version des Proteins mit dem Namen Cas7-11S führte. Mit Cas7-11S in der Hand verpackten sie das System in einen einzigen viralen Vektor, brachten es in Säugetierzellen ein und zielten effizient auf RNA ab.

Das Team plant nun zukünftige Studien zu anderen Proteinen, die mit Cas7-11 in den Bakterien interagieren, aus denen es stammt, und hofft auch, weiter an der Verwendung von Cas7-11 für therapeutische Anwendungen zu arbeiten.

„Stellen Sie sich vor, Sie könnten eine RNA-Gentherapie erhalten, und wenn Sie sie einnehmen, verändert sie Ihre RNA, aber wenn Sie die Einnahme beenden, hört diese Modifikation auf“, sagt Abudayyeh. „Das ist wirklich erst der Anfang, um dieses Toolset zu ermöglichen.“

Diese Forschung wurde teilweise finanziert durch das McGovern Institute Neurotechnology Program, K. Lisa Yang und Hock E. Tan Center for Molecular Therapeutics in Neuroscience, G. Harold und Leila Y. Mathers Charitable Foundation, MIT John W. Jarve (1978) Seed Fund for Science Innovation, FastGrants, Basis for Supporting Innovative Drug Discovery and Life Science Research Program, JSPS KAKENHI, Takeda Medical Research Foundation und Inamori Research Institute for Science.

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